“不知细叶谁裁出，二月春风似剪刀”，古人曾比喻春风像剪刀一样，裁剪出了杨柳细长宛转的枝条。春风当然不可能是真的剪刀，事实上，柳叶的细与不细应取决于它的基因，是基因决定了树木表现出细叶、阔叶或者是针叶的性状。但在科研中也确实有一些“剪刀”，像春风一样无声地“裁剪”着万千物种的表现形态，让它们生长成我们需要的模样。

　　在生物科技的基因编辑领域，有三大利器：锌指核酸酶（ZFN）、转录激活样效应因子核酸酶（TALEN）和起源于规律间隔成簇短回文重复序列的技术（CRISPR-Cas9）。相对来说，ZFN和TALEN是出现较早一些的技术，应用也比较广泛，而CRISPR-Cas9出现较晚，但表现非常抢眼，在生物医学的知名网站PubMed上，CRISPR-Cas9相关文献在几年内呈爆发式增长，2020年，CRISPR-CAS9基因编辑技术甚至还“跨界”赢得了诺贝尔化学奖。作为对新兴技术最敏感的专利申请领域，也随之有了量的突破。

图1 历年CRISPR-Cas9专利申请公开与授权公开量变化

（数据来源：Inspiro知识产权大数据与智慧服务系统 制图：中国知识产权网）

　　CRISPR-Cas9技术究竟魅力何在？CRISPR（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）是很多细菌都有的一种核苷酸序列，简单说来，它就像夹心饼干一样，两个重复序列夹着一个间隔序列，成为一块夹心饼干，很多个这样的饼干排列成一串，最前端再放一个前导序列，就大致构成了一个规律的、成簇的、短回文重复序列，也就是CRISPR。不同细菌的CRISPR也各有差异，最初，人们以为CRISPR是细菌的个性化标记，通过检测CRISPR来确定它是哪一种菌株。后来人们发现，CRISPR其实并不是细菌本身的序列，它是细菌自我保护的见证。当细菌被病毒、噬菌体等“外敌”入侵的时候，如果细菌不做任何反应，入侵的病毒和噬菌体会利用细菌内部的资源来不停地复制自己，最终细菌凋亡。所以为了积极防御，细菌内的Cas蛋白会冲上去把“外敌”的核苷酸切开，使之无法复制而死亡，并且切下来一小段核酸当做间隔区，再自己补上两个回文重复序列，做成一块“夹心饼干”，整合到自己的DNA里面去。每遇到一次“外敌入侵”，就做一块“夹心饼干”，漫长的岁月演化，就形成了冗长的CRISPR，装载在细菌基因里，形成特殊的“基因记忆”。当细菌遇到同一“外敌”的第二次入侵时，就能根据记忆而迅速地做出反应，有的放矢地把对方切开。CRISPR-Cas9就相当于是细菌的免疫系统。

图2 CRISPR-Cas9系统的简易示意图

（图片来源：CRISPR/Cas9 Immune System as a Tool for Genome Engineering；Arch. Immunol. Ther. Exp. (2017) 65:233–240）

　　黑色的方框是回文重复序列（图中标记为Repeat），在同一菌种内是比较固定的，只在不同菌种之间才有差异。“五颜六色”的方框是由外源基因决定的间隔序列（Spacer），外源基因根据研究需要而各式各样，所以它们的变化也很大。在它们前面的橙色方框是前导序列（Leader），包含启动子，可以让CRISPR基因座开始转录，转录之后形成长前体RNA（pre-crRNA），然后再变为一个一个的成熟核糖核酸片段（crRNA），主动识别特定的核酸，Cas9进行切割，这样就组成了一个基因编辑的小分队。

　　既然CRISPR-Cas9能切割核酸，那么除了被动地等待切割“入侵”的病毒噬菌体，是不是也能主动出击去切割人类的致病基因呢？科研人员为它找了一个新用途。如果我们人为设计一个核酸片段（sgRNA），“介绍”给CRISPR-Cas9系统认识，辅助蛋白（Cas9）就能按照我们的需要，在特定的细胞中、根据特定的DNA位置，切断双链。当人或动物细胞的DNA双链断裂以后，将会自动进行两种修复，一是NHEJ（非同源末端连接）修复，DNA断裂的两端强行重新再连接，但中间会丢掉一点小片段，二是HDR修复（同源重组修复），基因努力进行高保真的原样修复，但实际效果往往不保真。无论哪种，都会造成这段DNA中部分碱基的缺失、插入或突变，而DNA在编码蛋白时，是三个碱基编码一个氨基酸，一组一组地排列很有顺序，如果中间缺失或插入了几个碱基，虽然数量不多，但是三个一组的规律被打破，下游一系列的密码都随之改变（移码突变），就像多米诺骨牌一样，一组一组的密码子全都面目全非了。如果这段DNA恰好编码某个基因，可能这个基因就不再表达，如果这个基因恰好决定个体的某个性状，可能这个性状就会发生重大变化。例如玉米的产量改变（CN202010653774.X），绵羊的毛色改变（CN201610431828.1）等等。CRISPR-Cas9可以操作的基因非常多，因此其技术应用范围非常广泛。

　　以下是CRISPR-Cas9相关专利的几种重要分类号的分析，随着时间的推移，每种IPC分类号所涉及的专利数量都有增长，但增长幅度又不同步：

图3 不同IPC分类号下CRISPR专利的演变

（数据来源：Inspiro知识产权大数据与智慧服务系统 制图：中国知识产权网）

　　在图中可以看到，A23C9/12分类号的技术领域是鉴定细菌，在早期有少量出现，当时人们还以为CRISPR是细菌自身特有的基因，还在用它鉴定细菌的身份，随着认识的加深，这个分类的专利不再出现了。

　　C12N15/10、C12N15/11两个分类号的专利随着时间的推移而增加，它们往往侧重于CRISPR-Cas9系统中的核酸搭建，这时人们开始主动设计核糖核酸片段（RNA），例如申请文件中提到的成熟的RNA（crRNA）、向导RNA(gRNA)、单向导RNA（sgRNA）等，诱导Cas9去切割核酸，CRISPR-Cas9已经正式晋升为基因编辑工具，一把新的“剪刀”在生物科学领域横空出世。

　　A01K67/027相关的专利中往往是经过基因编辑的动物模型、基因突变体。例如专利CN107502608A（申请号201710803984.0），研究了一个从古至今的谜题——为什么有人“斗酒诗百篇”，有人却是沾酒即醉？究竟酒量是天生决定还是后天锻炼的结果？按照生物化学理论，酒精被人体吸收后，在乙醇脱氢酶（ADH）的作用下转变为乙醛，之后在乙醛脱氢酶（ALDH）的作用下转变为乙酸，人体内这两种酶的数量决定了酒量的大小，如果两种酶的水平都比较高，那么豪饮的美酒很快就可以代谢掉，人也不带醉意，如果两种酶的水平都比较低，那么酒精会非常缓慢地逐渐代谢，醒酒时间非常长，虽然“浓睡不消残酒”，但伤害还不算最大。最不好的一种情况是乙醇脱氢酶很高而乙醛脱氢酶很低，酒精会迅速变成乙醛，然后因为无法进一步代谢而大量蓄积在体内，乙醛对人有毒性，这也是很多危险的酒精中毒（实际上是“乙醛中毒”）发生的原因。当然，健康专家建议，无论一个人有多么好的酶基因，都最好不要饮酒。

　　ALDH2是乙醛脱氢酶一个重要亚型，位于人体第12号染色体上，通过CRISPR-Cas9技术制备一种ALDH2基因缺陷型的细胞株，可以模拟上述的病理过程，可用于研究与酒精摄入相关的疾病。专利CN107502608A删除了ALDH2基因的几个外显子中的小片段，得到ALDH2丧失活性的细胞株，这个细胞株为慢性疾病(如酒精性肝脏疾病及糖尿病)及肿瘤相关疾病的研究提供了有力工具。

　　如下图中所显示的，在ALDH2的第五个外显子（excon5）中切除4个碱基（4bp deletion），这段基因从正常的TCCCC"ATGG"ACGGAGA变成了TCCCCACGGAGA，中间的"ATGG"已经被剪切掉了：

图4 ALDH2酶基因编辑

（图片来源：中国专利CN107502608A）

　　辅助蛋白（Cas9）在切割核酸时依靠靶向特异性短序列（PAM）定位，靶向特异性短序列（PAM）是几个特定的碱基，一般出现在想要切割的核酸序列的羟基端（3'端），Cas选择它们作为下刀的落脚点。PAM在人和动物的基因中广泛存在，所以Cas可以切割的基因也非常多，相应地，可以制备的动物模型、可以治疗的疾病的种类也非常多。在中国发明申请公开中检索与疾病治疗相关的专利，除了上面举的例子之外，以下还有一些常见的类型：

图5 CRISPR-Cas9用于基因治疗的专利

（数据来源：Inspiro知识产权大数据与智慧服务系统 制图：中国知识产权网）

　　人类的特征就是会使用工具，而现代人的特征就是喜欢评价自己使用的工具。CRISPR-Cas9是一把簇新的基因编辑剪刀，究竟好不好用，还要和别的剪刀比一比才知道。检索CRISPR-Cas9与它的两个“前辈”——锌指核酸酶、转录激活样效应因子核酸酶同时出现的专利，看看专利申请人们认为CRISPR-Cas9都有哪些优点。通过列举关键词可以看出，成本低、效率高、工艺便捷，是它的最大特色：

图6 CRISPR-Cas9关键词出现频率示意图

（制图：中国知识产权网）

　　科技在发展，技术在迭代，CRISPR-Cas9的出现带动了一批论文发表和专利申请的热潮，未来它还将发挥怎样出色的基因编辑作用，这把“剪刀”如何在安全、合法、合理的范围内创造出多少世界所承认的奇迹，让我们拭目以待。（作者：吴秋颖）

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